琼脂糖凝胶电泳电压怎么设？场强换算与条带异常排查

琼脂糖凝胶电泳跑得好不好，电压设得对不对占很大比重。这里有个容易被忽略的前提：电泳仪上显示的是电压，而真正决定分离效果的是场强，也就是每厘米胶上的电压降。

一、电压要按场强换算确定

• 1、换算方法是：实际电压等于场强乘以两电极之间的距离。电极间距不同的两台电泳槽，跑同样样品所需电压是不一样的。
• 2、常规片段即约100 bp至10 kb，常用场强5至8 V/cm；追求高分辨率可降到4至5 V/cm慢跑，快速筛查可用8至10 V/cm，代价是分辨率下降。
• 3、大片段即12 kb以上，必须降低场强，一般1至3 V/cm。场强过高会明显发热，导致条带弥散、变形甚至凝胶软化。
• 4、加载电压前先让样品沉降，也可以在起始阶段用较低场强让样品进入凝胶后再提高，条带更整齐。

二、恒压、恒流、恒功率怎么选

• 1、恒压模式保持电压不变，是垂直电泳和多数琼脂糖电泳的常用选择；缓冲液温度上升后电流会随之变化。
• 2、恒流模式保持电流不变，多板同时电泳、或缓冲液离子强度有波动时更稳定。
• 3、恒功率模式对发热控制更直接，适合对温升敏感的实验。
• 4、缓冲液选择同样影响结果：TAE适合大片段分离，TBE离子强度与缓冲能力更高，适合小片段；缓冲液重复使用次数过多会出现离子强度下降、pH上升，进而导致条带模糊，应设定更换周期。
• 5、电泳槽内缓冲液液面要刚好覆盖凝胶1至2毫米，过低会造成条带扭曲，过高会增大电流与发热。

三、条带异常的常见成因

• 1、拖尾：核酸降解、上样量过大、缓冲液陈旧、电压过高、样品含盐过多都是常见原因，需要逐项排除。
• 2、微笑效应也就是条带两端向上弯曲：多与电场不均、边缘效应或电压过高有关，可降低场强、改善缓冲液液面与电极状态。
• 3、孔内残留荧光：大片段未迁出加样孔，或核酸与残留蛋白、杂质结合，难以进入凝胶基质。
• 4、条带淡或看不到：上样量不足、DNA跑出凝胶、凝胶浓度与片段大小不匹配，都应结合片段大小重新核对。
• 5、凝胶浓度要与片段匹配：0.5%至0.7%适合大片段，0.8%至1.2%为常规范围，2.0%至3.0%用于小片段；电极用后及时用蒸馏水冲洗，防止盐结晶腐蚀。

把场强算对、缓冲液管好、上样量控制住，绝大多数条带异常都能找到对应原因。